Als Nistplatz nutzen Turmfalken die Nester beispielsweise von Rabenvögeln ebenso wie Mauernischen hoch oben in Kirchtürmen, was ihnen den Namen eingebracht hat. Gerne nehmen sie dabei Nisthilfen in Anspruch und verschmähen auch nicht die Wohngemeinschaft mit der die gleichen Niststandorte nutzenden Schleiereule. In ein und demselben Nistkasten findet man dann hin und wieder die Jungvögel beider Arten. Ins Gehege kommen sie sich deshalb nicht, weil die Eulen nacht- und die Falken tagaktiv sind. Die Schleiereule beginnt mit ihrer Nachtschicht meist erst in der späten Dämmerung, wenn der Turmfalke sein Tagwerk längst beendet hat. Umgekehrt hat sich die Eule bei Sonnenaufgang schon wieder zur Ruhe begeben, wenn der Falke erneut auf die Jagd geht.
Die Eiablage erfolgt meist Mitte April, das Gelege besteht aus drei bis sechs Eiern. Der etwa vierwöchigen Brut folgt eine Aufzuchtzeit von weiteren vier Wochen, dann sind die jungen Turmfalken flügge und gehen selbst auf Beutefang. Wenn die Jungen noch klein sind, werden sie ausschließlich vom Weibchen gefüttert, das die Beute mit dem Schnabel zerkleinert und gleichmäßig unter dem Nachwuchs verteilt. Älteren Nestlingen wird dann aber die Beute als Ganzes übergeben, so dass die Jungen oft in Streit darüber geraten und bei schlechter Beuteversorgung immer wieder die Schwächsten auf der Strecke bleiben.
Feinde des Turmfalken sind insbesondere Steinmarder, die sich an den Eiern oder Jungvögeln vergreifen. Den Altvögeln kann schon einmal zum Verhängnis werden, dass sie mit ihrem auffälligen Rüttelflug dem Habicht oder Wanderfalken ins Auge stechen. Die Weibchen dieser beiden Greifvogelarten sind fast doppelt so groß wie der Turmfalke und Spezialisten für die Jagd auf Vögel im Flug.
